细胞遗传学实验方法淋巴细胞微核测定 [复制链接]

淋巴细胞微核测定是细胞遗传学分析中常用的方法之一,通过微核率的高低可以有效判断染色体畸变率与辐射损伤。#核辐射的危害#

一、淋巴细胞分离

分离使用Ficoll-Paque密度梯度分离淋巴细胞。将血液用磷酸盐缓冲盐水按1:1稀释，并在Ficoll-Paque上分层，血液+PBS:Ficoll的比例保持为4:3。血液在室温下以rpm离心35分钟。去除淋巴细胞层（血沉棕*层）并在PBS中以rpm洗涤两次，每次10分钟，然后用培养基RPMI洗涤。用血细胞计数器计数细胞密度。

二、培养条件

淋巴细胞在15ml锥形聚苯乙烯离心管中的5%CO2加湿培养箱中于37o培养。通常，每个培养物由2毫升培养基中的1x个细胞的初始密度组成。培养基由补充有10%胎牛血清2mML-谷氨酰胺、单位/ml青霉素、ug/ml链霉素和1.5%植物血凝素的RPMI组成。

在起始后44小时将微核测定细胞松弛素B加入到培养物中。细胞松弛素B阻止细胞完成胞质分裂，导致多核细胞的形成。细胞培养物中细胞松弛素B的最终浓度为3mg/ml。

在培养开始后72小时，使用细胞离心机(Shandon,Sewickley,PA)将淋巴细胞直接离心到载玻片上。然后将细胞以rpm的速度旋转到载玻片上10分钟。在室温下甲醇固定15分钟之前，让载玻片风干。载玻片在-20℃下储存在密封盒中，在N2下干燥。

三、细胞染色与微核测定

染色：将甲醇固定的载玻片在含有0.1%Tween20的PBS中孵育5分钟。从载玻片中排出多余的液体，并用含有0.2%Tween20的PBS1:1稀释40-50ul抗动粒抗体应用%Tween20。然后将载玻片盖上盖玻片并置于37oC的加湿室中1小时。在含有0.1%Tween20的PBS中洗涤两次，每次5分钟后，再次排出多余的液体，用1:50稀释的荧光山羊抗人IgG覆盖载玻片并再次孵育1H。因为荧光标记的抗体暴露在光线下会褪色，此步骤和所有后续步骤应在*灯下进行。将载玻片在加0.1%Tween20的缓冲液中冲洗两次，并在抗褪色溶液中用46-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(2ug/ml)复染。

对于淋巴细胞微核测试，对0个双核淋巴细胞（那些经历了一次有丝分裂分裂的细胞）进行检测，每个重复培养物中的个细胞，用于计算微核的数量。通过切换到荧光滤光片来确定动粒点的存在与否。

检测标准如下：1)细胞应具有完整的细胞质的圆形或椭圆形外观

2)细胞核应同样为圆形或椭圆形，具有完整的核膜

3)只有经历过一次核分裂的细胞才应检测微核的存在

4)仅当微核大小为主核的三分之一或以下时才应计数

5)微核的染色应与主核相似

6)微核应与主核明显分开。

复制指数(RI)，细胞分裂动力学的量度，通过计算每个样本个总细胞中含有1、2、3或更多细胞核的细胞百分比，从对微核进行检测的相同载玻片上进行检测。复制指数RI计算如下：

RI=(1x%单核细胞)+(2x%双核细胞)+(3x%tri)+(4x%四核细胞）……

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