近年来，CAR-T领域飞速发展。目前，全世界范围内在研的CAR-T细胞疗法药物超款，已有6款CAR-T细胞产品在北美上市（包括传奇生物今年获批的西达基奥仑赛），国内也有2款CAR-T产品成功获批。这些CAR-T产品的成功，为广大肿瘤患者带来了新的希望。
然而，CAR-T技术仍有较大的提升空间。传统的CAR-T细胞主要通过病*感染的方式进行制备，存在生产成本高、制备时间长、疗效低、*副反应强、随机插入和潜在致瘤风险等问题。
年8月31日，华东师范大学张楫钦、刘明耀、杜冰、李大力团队，浙江大医院*河教授团队在Nature上联合发表题为Non-viral,specificallytargetedCAR-TcellsachievehighsafetyandefficacyinB-NHL的研究论文，他们利用非病*系统的同源定向修复技术精准敲除PD1，首次生成非病*、基因特异性靶向CAR-T细胞，并在临床试验中论证了该新型CAR-T细胞疗法的安全性和有效性。
临床试验表明以这种方式生成的CAR-T细胞是安全的，在接受治疗患者中未观察到CAR-T治疗相关的神经*性和2级以上的细胞因子释放综合征。此外，这种新型CAR-T疗法在难治复发淋巴瘤患者中显示出卓越的治疗效果，完全缓解率为87.5%，客观缓解率高达%[1]。
据报道，这是迄今为止全球CAR-T细胞治疗难治复发淋巴瘤中具有高缓解率和低*副反应的最好的临床结果[2]。
新一代CAR-T细胞：非病*定点整合
传统的CAR-T细胞通过慢病*或逆转录病*来进行制备。病*将CAR序列随机插入到细胞基因组中，这可能会影响正常基因的表达，增加致癌性插入诱变的风险。
因此，在本研究中，学者们利用非病*系统“CRISPR/Cas9介导的同源定向修复(homologydirectedrepair,HDR)”来将CAR序列定点整合进T细胞基因组。
利用CRISPR介导的HDR
将CAR分别整合到四个特定位点
在这个过程中，CRISPR/Cas9会对整合位点进行切割，产生双链断裂（DSB），随后通过HDR对其进行修复。HDR以包含CAR序列的外源DNA供体为模板，该供体上有匹配整合位点上下游的序列，因此，HDR修复断裂DNA的同时会将CAR序列定点整合进基因组。
学者们将利用这种整合方式得到的CAR-T细胞（AAVS1-19bbz）与传统的慢病*方式产生的CAR-T细胞（LV-19bbz）进行对比，发现二者响应肿瘤细胞刺激后的增殖能力并无差异，且都能在体内或体外实验中有效根除肿瘤细胞。这些结果表明利用这种非病*的方法来生产CAR-T细胞是可行的。
两种方式产生的CAR-T细胞增殖能力相当
两种CAR-T细胞体外细胞*性类似，
且都能在小鼠实验中根除肿瘤
一举两得：超越传统CAR-T
PD-1是一种免疫抑制分子，可以预防自身免疫性疾病，但同时也会阻碍免疫系统攻击癌细胞。PD-1/PD-L1信号通路是抑制T细胞功能的重要免疫检查点，有不少研究报道了PD-1敲除可有效增强CAR-T细胞的功能。
在安全位点AAVS1上验证了非病*定点整合CAR的可行性之后，学者们尝试利用这种方法将表达靶向CD19的CAR序列精确整合到T细胞基因组的PD1基因位点，在表达CAR的同时破坏PD1基因，下调PD-1免疫检查点的蛋白表达，从而增强CAR-T细胞的能力。
对比试验显示，靶向CD19的非病*PD1定点整合CAR-T细胞（PD1-19bbz），其增殖能力显著高于慢病*系统产生的CAR-T细胞（LV-19bbz），且无论在PD-L1高表达还是低表达的肿瘤细胞中，PD1-19bbz都表现出更强大、更持久的杀伤效果，小鼠存活率得到显著提升。
PD-1位点整合的CAR-T，其增殖能力增强
PD1-19bbz在体内外实验中具有最强的肿瘤细胞杀伤能力
PD1-19bbz能更有效地清除小鼠肿瘤，提高存活率
临床试验：安全有效
基于PD1-19bbz在临床前试验中的优异表现，学者们随后开展了针对复发难治性侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的I期临床试验。
淋巴瘤患者治疗过程中由于肿瘤细胞的快速杀灭和细胞因子释放往往会导致患者出现全身性的严重反应，这在临床上被称为细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关的神经*性综合征（ICANS）。
学者们利用PCR技术和流式细胞术检测发现，在接受PD1-19bbz回输治疗的8例患者中，CAR-T细胞都能在患者体内快速扩增并持续存在。此外，学者们在患者体内未观察到与CAR-T相关的神经*性和2级以上细胞因子风暴事件，这表明PD1-19bbz疗法具有一定的安全性。
PD1-19bbz的*性较轻
在为期12个月的中位观察期内，学者们发现所有难治复发淋巴瘤患者均能对治疗响应，客观缓解率（ORR）达%，有87.5%（7/8）的患者获得疾病完全缓解（CR）的效果。截至文章发表时，有5例患者无癌生存已超过1年，首位患者无癌生存已超2年，目前仍处于疾病完全缓解的状态[2]。
“经过细胞治疗后身体感觉一下子就恢复正常了，亲朋好友也都说我是奇迹般地康复了，现在闲暇时还会去打打羽毛球，完全恢复了患病前的生活状态。感谢新型CAR-T细胞疗法，让我还能看到儿子上大学。感谢浙大一院*河院长团队的精心治疗，帮助我战胜病魔，获得重生。”本次临床试验的首位患者孙先生在接受采访时说道[2]。
患者接受治疗前后体内肿瘤情况对比
最后，学者们利用单细胞测序技术研究PD1-19bbzCAR-T细胞体内作用机制，结果表明PD1-19bbz中存在高比例的记忆性T细胞，且具有更强大的抗肿瘤免疫功能，进一步验证了非病*PD1定点整合的CAR-T细胞的优势。
参考资料
[1]Zhang,J.,Hu,Y.,Yang,J.etal.Non-viral,specificallytargetedCAR-TcellsachievehighsafetyandefficacyinB-NHL.Nature().
[2]吴雅兰,柯溢能.难治复发淋巴瘤？浙大新型细胞治疗技术带来生的希望.RetrievedSep5,from