罗工秘籍系列自年发布以来，就深受小伙伴们的欢迎。而自本周起，罗工又有新系列和大家见面了：罗工宝典，其中都是精心整理的完整实验操作方案，希望此系列可以对大家的科研有所裨益。
调节性T（Treg）细胞是CD4+T细胞的一个亚群，它表达Foxp3作为转录因子。Treg细胞通过调节免疫反应，在免疫耐受和维持体内平衡中发挥着重要作用。Treg细胞的主要作用是抑制效应T（Teff）细胞的增殖和细胞因子如IFN-γ、TNF-α和IL-2的产生。研究表明，Treg细胞抑制Teff细胞功能的能力会在持续的病原体感染和癌症发展过程中增强。在参与T细胞抑制的因素中，表达程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的终末耗竭性T（Texh）细胞和Treg细胞被广泛认为是抗原持久性和抑制环境的标志。Treg细胞表达PD-1的水平与其抑制T细胞增殖的抑制能力强弱相关。
图1.Treg细胞在癌症中的作用
实验前准备
步骤1
步骤2
步骤3
1.RPMI培养基、FBS、双抗、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇
2.FACS缓冲液
3.红细胞裂解液
4.70μm滤器
5.固定破膜试剂盒
6.相关鉴定指标抗体、死活染料
1.磁珠分选缓冲液
2.Miltenyi细胞分离试剂盒
3.Miltenyi分选柱
4.40μm滤器
1.细胞增殖试剂盒
2.anti-CD3/CD28功能抗体或磁珠
3.检测细胞因子ELISA试剂盒
1.脾脏样本单细胞悬液制备与Treg鉴定
1）脾脏淋巴细胞的分离
a)取小鼠脾脏置于2%RPMI培养基（2%FBS+1%双抗）中。
b)使用注射器柱塞研磨，并通过70μm细胞过滤器，用2ml2%RPMI培养基冲洗。
c)补充适量2%RPMI培养基，4°C，g离心5min，丢弃上清，用1ml红细胞裂解缓冲液重悬细胞，室温孵育5min。
d)加适量2%RPMI培养基中止裂解，4°C，g离心10min，丢弃上清，在RPMI完全培养基（10%FBS+1%双抗+1%L-谷氨酰胺+50μM2-巯基乙醇）中以1×cells/ml的密度重悬细胞，等待后续实验。
2）Treg细胞的表型分析鉴定
a)转移50μl淋巴细胞（5×cells）到96孔板中，再加入μlFACS缓冲液，4°C，g离心2min。
b)丢弃上清，再使用μlFACS缓冲液洗2遍，4°C，g离心2min。
c)准备含抗体的染色缓冲液（50μl/孔，抗体用量参考说明书）：anti-CD4，anti-CD25，anti-PD-1，死活染料。
注意：为了进一步分析活化Treg细胞的表型，可添加anti-CD进行细胞表面标记物染色。
d)每孔用50μl抗体缓冲液重悬细胞，4°C避光孵育20min，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，4°C，g离心2min。
e)按厂家说明书制备固定缓冲液μl，在4℃黑暗中固定细胞20min。用渗透性洗涤缓冲液(根据制造商的说明书准备)洗涤细胞2次，4°C，g离心2min。
f)制备细胞内Foxp3染色的抗体溶液（抗体用量参考说明书），用50μl含anti-Foxp3抗体溶液重悬细胞。
g)4°C避光孵育20min，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，4°C，g离心2min。用μlFACS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪检测细胞表型。
图2小鼠脾脏Treg细胞表型分析
2.CD4+CD25+Treg细胞的分离纯化（磁珠分选）（MiltenyibiotecCat:--）
a)按步骤1）获得1×cells/ml细胞悬液。加入10mlT细胞分离缓冲液清洗细胞。4°C，g离心10min。弃去上清，用40μl缓冲液重悬细胞。
b)CD4+T细胞磁性标记：加入10μl生物素-抗体混合物搅拌均匀，4°C孵育10min。
c)加入30μl缓冲液，20μl抗生物素微珠标记non-CD4+T细胞，10μlCD25-PE抗体。搅拌均匀，避光孵育15min。
d)加入2ml缓冲液，将细胞通过一个40μm的细胞过滤器，到新的50ml的管中，清除细胞碎片。4°C，g离心10min，丢弃上清，用μl缓冲液重悬细胞，浓度最高可达1.25×个细胞。
e)收集通过分选柱的未标记细胞。加入2ml缓冲液清洗分选柱，4°C，g离心10min。将分离的CD4+T细胞完全弃去上清，用90μl缓冲液重悬。
f)CD25+细胞磁性标记：加入抗PE磁珠10μl，混合均匀，4℃避光孵育15min。
g)加入2ml缓冲液，4°C，g离心10min，丢弃上清，用μl缓冲液重悬细胞，浓度最高可达1×cells。
h)富集CD4+CD25+Treg细胞：将细胞涂于柱上进行阳性选择，并加入2ml缓冲液冲洗柱。重复3次。
i)当最后洗涤后柱为空时，在柱上加1ml缓冲液，用柱塞冲洗磁性标记的CD4+CD25+细胞。
j)重复h-i步骤，提高分离的CD4+CD25+Treg细胞的纯度。用FACS缓冲液洗涤细胞，4°C,g离心10min。丢弃上清，将分离的CD4+CD25+Treg细胞重悬于RPMI完全培养基中，浓度为2×cells/ml。
k)为了检测分离的CD4+CD25+Treg细胞的纯度，从总分离的CD4+CD25+Treg细胞中提取的2×个细胞。用50μl含anti-CD4和细胞活力检测试剂的FACS缓冲液。
l)4°C避光孵育20min。用FACS缓冲液洗涤细胞，4°C，g离心2min。洗涤后用μlFACS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪检测纯度。
m)从活细胞中分析Treg细胞纯度，确认CD4+CD25+细胞纯度。
图3Treg细胞分离后纯度分析
3.CD4+CD25+Treg和CD8+T体外抑制实验
a)为了制备anti-CD3/CD28包被的磁珠：将适当体积的磁珠转移到15ml管中（2.5μl/1xcells）。加入等体积的PBS并混合。4°C，g离心2min，丢弃上清液。在完全培养基中稀释磁珠（50μl/孔）。
b)取50μlCD4+CD25+Treg细胞（1×cells/孔）。每孔加50μlCD8+T细胞作为应答T(Tresp)细胞（1×cells/孔）。每孔加入50μl稀释后的anti-CD3/CD28。
注意：在此步骤中，标记和建立对照孔如下:未刺激CD8+T（不含anti-CD3/CD28）；刺激的CD8+T细胞（含anti-CD3/CD28）；刺激的Treg细胞（含anti-CD3/CD28）。Treg细胞可以用完全培养基稀释，以不同比例的Tresp细胞与Treg细胞（1:0.25-1:1）共培养。
c)各孔加50μl或适当体积的培养基，总体积为μl。用铝箔盖住板子，放入二氧化碳培养箱中37°C培养72h。
d)培养72h后进行细胞因子产生分析，将每孔上清液分离到另一个板上，进行酶联免疫吸附试验（ELISA），检测IFN-γ水平。
e)将每孔上清液分离后，用FACS缓冲液清洗含有细胞的培养皿，4°C，g离心2min，洗3次。
f)洗涤后，弃去上清。用50μl的抗体缓冲液（anti-CD4、anti-CD8和细胞活力检测试剂）重悬细胞，对增殖的CD8+T细胞进行染色（在获得CD8+T细胞时，可使用追踪细胞增殖的染料进行标记）。4°C避光孵育20min。
g)4°C，g离心2min，洗两次。洗涤后，弃上清，用μl固定缓冲液4℃避光固定20min。
h)4°C，g离心2min，洗两次。μlFACS缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测标记CD8+T细胞增殖情况。
图4活化的Treg细胞对CD8+T细胞应答的影响
体外抑制实验的优势在于，因为只有Tresp细胞与Treg细胞共培养，所以它可以直接评估Treg细胞对CD8+T细胞反应的抑制作用。除CD8+T细胞外，也可以通过改变实验条件来评估Treg细胞对其它免疫细胞(如树突状细胞或自然杀伤细胞)的影响。
参考文献：
[1]ParkHJ,OhJH,HaSJ.PhenotypicandFunctionalAnalysisofActivatedRegulatoryTCellsIsolatedfromChronicLymphocyticChoriomeningitisVirus-infectedMice.JVisExp.Jun22;():.doi:10./.PMID:.
[2]ZengG,etal.RegulatoryTCellsinCancerImmunotherapy:BasicResearchOut