下面作者就来验证Cd80在tSCs中的作用。首先作者将鳞状皮肤癌细胞系PDVC57中将Cd80敲除（下图A），WBblot也显示Cd80成功被敲除。进一步验证这些细胞系的生长效应，首先在C57/BL6小鼠中，敲除系相比对照组肿瘤大小及重量都有一个明显的下降（下图B）。而在Rga2-Null中（类似于Cd80突变体），两组肿瘤大小和重量都无明显变化（下图C）。在下图D中，CTL-Depleted老鼠中，两者的肿瘤大小和重量都无明显变化，而CTL-Depletedmice相当于CD8+Tcells缺陷型。通过以上数据说明Cd80的确是tSCs肿瘤复发的罪魁祸首，并且是能逃避免疫系统的封杀的关键所在。另外，当Cd80被消融时，CD8+T细胞的浸润、增殖和抗肿瘤活性（根据颗粒酶B、干扰素-γ[IFN-γ]和肿瘤坏死因子α的产生来判断）都显著增强（下图EF）。通过这些结果发现Cd80是tSCs抵抗免疫攻击所必须的。
Cd80能够保证tSCs抵抗免疫攻击，但是什么机制让Cd80免于免疫系统的攻击呢？带着这个问题，作者又进行了验证。
由于大多数内源性免疫抑制细胞在与细胞*性T细胞作用之前被清除，因此作者推测tSCs具有直接抑制细胞*性CD8T细胞功能的能力。因此作者集中精力研究tSCs上的Cd80如何减弱细胞*性T细胞的活性。如下图A所示，细胞共培养实验发现SCC细胞上的CD80削弱了CTL(细胞*性T淋巴细胞)的增殖。同时，Cd80还显著的降低了细胞因子的产量（下图B）。Cd80可以直接结合CTL表面的CTLA4，并弱化CTL的活性。因此，在下图C中，无Cd80的肿瘤细胞是最小的，而含有CTLA4ab的细胞相比对照组也明显的减少了肿瘤细胞的大小。
通过以上数据表明肿瘤细胞上Cd80通过与CTLA4结合的方式，来抑制细胞*素T细胞的活性。
除此之外，我们再讲一下Tregs细胞，Tregs又称调节性T细胞，是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群。Tregs也是维持机体免疫耐受的重要因素之一。前期的研究发现，Tregs在经历CTLA4Ab处理后会被清除，因此作者还研究了肿瘤细胞上Cd80对Tregs的影响。因此，在上图D中，流式检测发现在未经治疗的小鼠中，与Cd80（+）SCCs相比，Cd80（-）中的Tregs绝对数量和频率明显减少。这与Cd80消融后肿瘤生长减少是一致的，因此CD80消融与CTLA4阻断Abs效果是一致的。在上图E中，作者将CD80不同的SCC细胞移植到Foxp3DTR小鼠（Tregs缺失）中时，CD80（+）肿瘤仍然比CD80（-）生长的更快。这些数据说明，即使Tregs缺失，tSCsCD80仍然抑制CTL的功能。
通过以上的数据说明tSC-CD80通过参与和间接增加Tregs数量来减弱细胞*性T细胞的活性。至此，已经对tSCs逃避免疫治疗以及复发的机制有很清楚的了解了。最后，作者又再一次通过一系列的实验来证明CD80是TGF-βrespondingtSCs抑制免疫攻击和存活的关键。
所以在下图中，作者设计了一个新的策略，使其达到在TGF-βrespondingtSCs中特异性的沉默Cd80（下图A）。进一步通过IMF的切片以及流式等，都证明了Cd80能够阻止tSCs被ACT免疫抑制（下图B-C）。另外，作者还对ACT处理后的组织进行分析，发现Cd80也是这些TGF-βrespondingtSCs存活的关键，并且也是与CTLA4是有关的（下图D-H）。综上所述，CD80是tSCs抵抗免疫攻击以及在ACT后存活的关键所在，因此在未来的免疫治疗中就可以针对这个发现做出改变，从而防止免疫治疗后的癌症复发。
那么总结来了，该文的思路非常的清晰，逻辑性很强，数据也非常的靠谱。那么说说本文的亮点吧，主要有以下四点：1、肿瘤起始干细胞增强了对T细胞免疫治疗的抵抗力2、TGF-βresponding干细胞是癌症复发的关键细胞3、肿瘤起始干细胞可获得CD80来调节细胞*性T细胞的攻击4、CTLA4-或TGF-β阻断抗体可使干细胞对治疗更敏感，未来可以加强免疫治疗效果。
除此之外，我们再来说一下单细胞。自从单细胞技术诞生以来，很多的研究都集中在解决之前不能解决的单细胞问题，比如异质性等等。不过重要的还是单细胞用来研究的科学问题，单细胞测序仅仅是一项技术，因此在本文中就有很好的应用，但本文的亮点却不全是单细胞测序。因此，未来大家的研究还是着重利用单细胞来回答有意思的科学问题。
《国科风教你单细胞测序》系列文章，全文完！
我是国科东方绿豪克，我是生命科学方向的博士。