背景：结直肠癌（Colorectalcancer，CRC）是一种潜在的恶性肿瘤，预后差，目前缺乏可用于改善预后的有效疗法。C18H17NO6(（AUCAN）是从云南省一种特殊植物中提取的二苯并呋喃，是一种天然抗癌药物，对多种癌症具有较强的抑制作用。本研究主要探究了AUCAN对结直肠癌的作用，并通过蛋白质组学分析进一步探索其潜在机制。
方法：使用CellCountingKit-8测定法和免疫荧光染色法来研究AUCAN对HCT-细胞和RKO细胞活力和增殖的影响。采用流式细胞术测定AUCAN给药后HCT-和RKO细胞的凋亡情况。通过细胞集落形成实验，伤口愈合实验和Transwell侵袭实验研究AUCAN对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响。同时，通过PET-CT观察体内AUCAN给药10mg/kg和20mg/kg后肿瘤组织的能量代谢和生长情况，还通过血液常规和肝功能检查评估了AUCAN治疗的副作用。采用苏木精-伊红染色（hematoxylinandeosinstaining），TUNEL染色和免疫组化进一步测定了体内RKO细胞的增殖和凋亡。此外，采用蛋白质组学分析和功能聚类分析确定了参与AUCAN治疗的差异表达蛋白（Differentiallyexpressedproteins，DEPs）。
结果：本研究结果表明，AUCAN能有效抑制HCT-和RKO细胞的迁移能力，促进细胞凋亡。同时，AUCAN能显著抑制裸鼠结直肠肿瘤的生长和体积的增大，抑制肿瘤组织中RKO细胞的存活，并对血常规和肝功能无任何副作用。此外，还鉴定出24种上调蛋白和42种下调蛋白。但功能聚类分析隐藏了丰富的生物过程、细胞成分、分子功能以及这些蛋白质参与调控的细胞相关代谢途径。最后，蛋白质相互作用分析揭示了DEPs之间的调控联系。
结论：AUCAN在血常规和肝功能方面发挥了显著的抗肿瘤作用，并通过蛋白质组学分析初步探讨了其作用机制。
Fig.1.AUCAN对HCT-和RKO细胞活力的影响。（a,b）为HCT-细胞从log（0）到log（1.5）和RKO细胞从log（-1）到log（1.5）的IC50剂量反应曲线，n=5/组。（c,d）HCT-和RKO细胞的对照组和AUCAN组的细胞数图像，分别为5个/组，比例尺=50μm。（e,f）不同AUCAN浓度对HCT-和RKO细胞的抑制率。所有数据均以平均值±标准差（M±SD）表示。***表示P0.；IC50，表示50％抑制浓度；h，表示小时。
Fig.2.AUCAN对HCT-细胞和RKO细胞生长的影响。（a）为HCT-细胞的对照组、IC20组和IC50组的EDU免疫荧光染色图像。细胞核呈蓝色，EDU阳性细胞呈红色。（b）为RKO细胞的对照组、IC20组和IC50组的EDU免疫荧光染色图像。细胞核呈蓝色，EDU阳性细胞呈红色。（c）为HCT-细胞的对照组、IC20组和IC50组的细胞增殖率（EDU/DAPI）的柱状图。（d）为RKO细胞的对照组、IC20组和IC50组的细胞增殖率（EDU/DAPI）的柱状图。所有数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，n=5/组。*表示P0.05，**表示P0.01和***表示P0.。比例尺=μm。EDU，为5-乙炔基-2-脱氧尿苷；IC20，表示20％抑制浓度；IC50，表示50％抑制浓度；DAPI，为4,6-二氨基-2-苯吲哚。
Fig.3.采用流式细胞仪分析AUCAN给药后对CRC细胞凋亡的影响。HCT-和RKO细胞的对照组（注射DMSO），AUCAN-IC20组和AUCAN-IC50组分别进行给药处理（HCT-细胞：8μMDMSO，8μMAUCAN和3.2μMAUCAN;RKO细胞：5μMDMSO，2μMAUCAN和5μMAUCAN）。（a）为流式细胞术检测图像和（b）HCT-细胞的对照组，IC20和IC50组的细胞凋亡率柱状图。（c）HCT-细胞的对照组、IC20组和IC50组的细胞周期。*P0.05表示S期时，IC20组与对照组相比具有显著性差异；**P0.01表示G2期时，IC20组与对照组相比具有显著性差异；***P0.表示G1期和S期时，IC50组与IC20组相比具有显著性差异。（d）为流式细胞术检测图像和（e）RKO细胞的对照组，IC20和IC50组中的细胞凋亡率柱状图。（f）RKO细胞的对照组、IC20和IC50组的细胞周期。*P0.05表示G2期时，IC50组与IC20组相比具有显著性差异。所有数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，n=5/组。*表示P0.05，**表示P0.01和***表示P0.。IC20，表示20％抑制浓度；IC50，表示50％抑制浓度；DMSO，表示二甲基亚砜；，表示HCT-细胞。
Fig.4.通过细胞集落形成实验，分析AUCAN给药后对CRC细胞存活状态的影响。HCT-和RKO细胞的对照组（注射DMSO），AUCAN-IC20组和AUCAN-IC50组分别进行给药处理（HCT-细胞：8μMDMSO，8μMAUCAN和3.2μMAUCAN;RKO细胞：5μMDMSO，2μMAUCAN和5μMAUCAN）。（a）为对照组、IC50组和IC20组的RKO细胞的明场图像，比例尺=50μm。（b,d）AUCAN给药后HCT-细胞的对照组、IC50组和IC20组的集落形成分析。（c,e）AUCAN给药后RKO细胞的对照组、IC20组和IC50组的集落形成分析。IC20，表示20％抑制浓度；IC50，表示50％抑制浓度；DMSO，表示二甲基亚砜。所有数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，n=5/组。*表示P0.05，**表示P0.01和***表示P0.。
Fig.5.通过伤口愈合实验，分析AUCAN对CRC细胞转移的影响。HCT-和RKO细胞的对照组（注射DMSO），AUCAN-IC20组和AUCAN-IC50组进行给药处理（HCT-细胞：8μMDMSO，8μMAUCAN和3.2μMAUCAN;RKO细胞：5μMDMSO，2μMAUCAN以及5μMAUCAN）。通过伤口愈合测定法在（a）HCT-细胞和（b）RKO细胞中于0、12、24h进行细胞迁移测定，比例尺=μm。（c）HCT-细胞和（d）RKO细胞迁移速率的定量分析。所有数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，n=5/组。*表示P0.05，**表示P0.01和***表示P0.。IC20，表示20％抑制浓度；IC50，表示50％抑制浓度；h，表示小时。
Fig.6.AUCAN对体外HCT-和RKO细胞转移的影响。HCT-和RKO细胞的对照组（注射DMSO），AUCAN-IC20组和AUCAN-IC50组进行给药处理（HCT-细胞:8μMDMSO,8μMAUCAN,and3.2μMAUCAN；RKO细胞:5μMDMSO,2μMAUCAN,和5μMAUCAN）。用Transwell法分析（a）RKO细胞和（b）HCT-细胞的迁移和侵袭。比例尺=50μm。（c,e）RKO细胞和HCT-细胞的对照组，IC20和IC50组中每个视野的迁移细胞。（d,f）RKO细胞和HCT-细胞的对照组，IC20和IC50组中的迁移倍数的变化。所有数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，n=5/组。*表示P0.05，**表示P0.01和***表示P0.。IC20，表示20％抑制浓度；IC50，表示50％抑制浓度。
Fig.7.AUCAN给药对裸鼠肿瘤生长的影响。分别以10mg/kg和20mg/kg的剂量进行DMSO（对照组）和AUCAN给药后，裸鼠的（a）形态图，（b）体重，（c）PET-CT测定图像和（e）肿瘤SUV（Standarduptakevalue），比例尺=1cm。（d）对照组、10mg/kg和20mg/kg给药组的裸鼠在第3、6、9、12、15和18天的相对肿瘤体积。（f）对照组、10mg/kg和20mg/kg给药组的裸鼠体内肿瘤的荧光图像。（g）对照组、10mg/kg和20mg/kg给药组的裸鼠体内肿瘤的荧光强度值的柱状图。（h）10mg/kg和20mg/kg给药组的裸鼠在第3、6、9、12、15和18天的裸鼠体内的肿瘤增值率的柱状图。（i）肿瘤裸鼠在干预后2、4、5、8、10、12、14、16、18、20、22天的体重增长趋势图。（j）对照组、10mg/kg和20mg/kg给药组的裸鼠体内肿瘤的HGB浓度柱状图。（k）对照组、10mg/kg和20mg/kg给药组的裸鼠体内肿瘤的AST、ALT柱状图。（l）对照组、10mg/kg和20mg/kg给药组的裸鼠体内肿瘤的WBC和PLT的柱状图。所有数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，n=10/组。*表示P0.05，**表示P0.01。Con，表示对照组；C18H17NO6，表示AUCAN；d，表示天；HGB，表示血红蛋白；ns，表示无显著性；WBC，表示白细胞；PLT，表示血小板；AST，表示天冬氨酸转氨酶；ALT，表示丙氨酸转氨酶。
Fig.8.AUCAN干预对裸鼠体内细胞增殖和凋亡的影响。（a）对照组，10mg/kgAUCAN组和20mg/kgAUCAN组中的裸鼠体内肿瘤组织的HE染色图像，比例尺=μm。（b）对照组，10mg/kgAUCAN组和20mg/kgAUCAN组中，免疫组化Ki67在裸鼠体内的表达图像，比例尺=μm。（c）三组裸鼠体内肿瘤组织的TUNEL染色图像，凋亡细胞被染成红色，细胞核被染成蓝色，比例尺=μm。（d）对照组，10mg/kgAUCAN和20mg/kgAUCAN组的Ki67+阳性细胞数所占百分比的柱状图。（e）对照组，10mg/kgAUCAN和20mg/kgAUCAN组的TUNEL阳性细胞数所占百分比的柱状图。所有数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，n=10/组。*P0.05，表示10mg/kgAUCAN组与对照组相比具有显著差异；#P0.05，表示20mg/kgAUCAN组与对照组相比具有显著性差异；P0.05，表示20mg/kgAUCAN组与10mg/kgAUCAN组相比具有显著性差异；Con，表示对照组；C18H17NO6，表示AUCAN；HE，表示苏木精和伊红染色；DAPI，表示4,6-二氨基-2-苯基吲哚；TUNEL，表示末端脱氧核苷酸转移酶dUTP生物素缺口末端标记法。
Fig.9.差异表达蛋白（Differentiallyexpressedproteins，DEPs）的筛选。（a）鉴定上调和下调的蛋白质。（b）DEPs火山图。倍数变化1.2或5/6，P0.05表示表达蛋白差异显著。绿色的点代表差异表达下调蛋白，红色的点代表差异表达上调蛋白，黑色表示非差异表达蛋白。（c）DEPs生物功能的富集分析图。（d）对照组和AUCAN组中已鉴定蛋白质的热图。所有数据均以平均值±标准差（M±SD）表示，n=4/组。
Fig.10.GO和DEP的途径富集分析。（a,b）对DEPs进行GO分析和KEGG分析图。（b）DEPs的蛋白质-蛋白质相互作用网络。富集因子表示该通路项中所注释的DEP数与该通路项中所注全部蛋白质数之比。红色的点表示蛋白上调，绿色的点表示下调蛋白。生物过程、细胞定位、分子功能或信号通路都用矩形表示。蓝色表示P值较高，*色表示较低。实线表示相互关联的蛋白质（基因-蛋白质（基因），虚线代表相关的代谢途径的蛋白质（基因）。所有数据均以平均值±标准差（M±SD）表示。GO，表示基因本体论；KEGG，表示京都基因和基因组途径分析百科全书。
本文以题为“AnticolorectalCancerEffectsofAUCAN:EffectstoSuppressProliferation,Metastasis,andInvasionofTumorCells”于年10月发布在期刊BioMedResearchInternational上。是昆明医科大学动物学系神经科学研究所王廷华老师的研究成果。
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